脊髓性肌萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色（sè）体隐性遗传病，居（jū）儿童（tóng）致（zhì）死性（xìng）常染色体隐（yǐn）性遗传病的第（dì）2位。位（wèi）于染色体5q11.2～q13.3上的运（yùn）动神（shén）经元（yuán）存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因。

　　人基因组有两个（gè）紧邻的高度同源的SMN基因：端（duān）粒侧的SMN1和着丝（sī）粒侧的SMN2，两者（zhě）仅有（yǒu）5个碱基（jī）不（bú）同。SMN1是主要功能（néng）基因（yīn），该基因（yīn）突变可导（dǎo）致SMA发病，SMN2为临床表型（xíng）的调节基（jī）因，影响病情的（de）严重程（chéng）度（dù），其拷贝（bèi）数（shù）增（zēng）加可减轻（qīng）SMA表型（xíng）。目前已（yǐ）知约94％的SMA患者为SMN1基因第7和（或）第8外显（xiǎn）子纯合（hé）缺失所致，少（shǎo）数（shù）病（bìng）例（lì）可（kě）由SMN1基因（yīn）点突变或小的（de）缺（quē）失引起。

　　SMN1基因外显子缺失检测的（de）意义

　　SMA在人群中的发（fā）病率为1/5000～1/10000，群（qún）体携带者频率为1/35～1/50，是出生（shēng）缺陷的高危因素（sù），因此极有必要进行SMA携带者的（de）人群筛查，并通过产前（qián）诊断技术降低人（rén）群（qún）中（zhōng）SMA患儿的（de）出生率。

　　临床上将（jiāng）SMA分为（wéi）Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即婴儿型、中间型（xíng）和少年（nián）型（xíng），严重程度依次递减。神经（jīng）专科医生一（yī）般根据患者（zhě）发（fā）病年龄、临（lín）床表现（xiàn）及病情进展程度进行（háng）临床诊断，辅助检查方法（fǎ）包（bāo）括肌电图、肌酶和肌肉活检，结（jié）合（hé）家族史和SMN1基因分析（xī）可进行（háng）确诊。由于SMA患儿中约94%为SMN1基（jī）因外显子（zǐ）纯合缺失，因此，SMN1基因缺（quē）失检测对于SMA的诊断具有更高的灵（líng）敏度和特异性。且对不（bú）同型（xíng）的SMA患者，SMN1纯（chún）合缺失率没（méi）有显著差异（yì），所以，SMN1纯合缺失的检测对于（yú）不同（tóng）型SMA患者具有相同的临床诊断价（jià）值。在欧美人群中（zhōng），SMN1基因纯合缺失检测已成为（wéi）诊断和排除（chú）诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检测（cè）试剂的现状

　　目前，SMN1基因（yīn）外（wài）显（xiǎn）子缺（quē）失检测（cè）试（shì）剂较为缺乏，临（lín）床检验（yàn）实验室较为公认的方（fāng）法是PCR结合限制（zhì）性片段长度（dù）多态性（PCR-RFLP）的方（fāng）法。但该（gāi）方法（fǎ）操作较为繁琐，且重复性（xìng）差，不利于标准化，不易推广。同时（shí），这种方法（fǎ）只能检测（cè）出纯（chún）合缺失，无法确认杂合缺失。

　　荷兰的（de）SMAMLPA检测试剂（jì）可对待测靶序（xù）列进（jìn）行半（bàn）定量分（fèn）析，因（yīn）此既可检测（cè）纯合缺失，亦可（kě）确认杂（zá）合缺失。在国内外已（yǐ）有多篇文献报道采（cǎi）用该（gāi）方法进行SMA患者诊断和SMA携带者筛查。但该产（chǎn）品目（mù）前（qián）仍为“仅用于研究”的试（shì）剂（jì），尚（shàng）未按照体（tǐ）外诊断类医疗器械上市（shì）（98/79/EC）。

　　2015年底，原（yuán）国家食品药品监管（guǎn）总局批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上（shàng）市（shì）。该（gāi）产品采用多（duō）重（chóng）实时荧（yíng）光（guāng）MGB-TaqMan探针PCR法，以人基因组单拷（kǎo）贝基因RPP40为（wéi）内参（cān）基因，对SMN1基因第7外显子和第8外显（xiǎn）子拷贝数进（jìn）行相对定量检测，用于SMA患者的体外辅助分子诊断。SMN1基因外（wài）显子缺失检测（cè）的难点之（zhī）一在于排除高（gāo）同源（yuán）性基因SMN2的干扰（rǎo），特别是对于（yú）SMN2高拷贝数的受（shòu）试者，需保（bǎo）证（zhèng）结果（guǒ）的准确可靠。该产品通（tōng）过对实时荧光PCR相对（duì）定量、绝对（duì）定量（liàng）技术进行系统（tǒng）整合（hé），并在（zài）反应体系中加（jiā）入特定化学组分，以抑制PCR引物3’端的（de）胞嘧（mì）啶（dìng）（C）与（yǔ）胸腺嘧啶（T）的错配，增加PCR扩增的特异性，从而有效控制SMN2基因非特异性扩增对检测（cè）结果（guǒ）的影响（xiǎng），准（zhǔn）确（què）检出高拷贝数SMN2样本中SMN1基因（yīn）第7和第8外显子（zǐ）的（de）缺失（shī）情况。

　　鉴于国（guó）内（nèi）外尚无任何按照体外诊断试（shì）剂批准上（shàng）市的SMA分子诊断产品，因（yīn）此（cǐ）临床试验方（fāng）案中依据EMQN关于《SMA分子诊断最（zuì）佳实践（jiàn）指南》，采用了国内外SMA体外辅（fǔ）助分子诊断领域公认的PCR-RFLP法作为（wéi）对照（zhào）方法。临床试验共完成1069例（lì），其中正常对照组777例，SMA病（bìng）例组292例，统计（jì）分析（xī）结果显（xiǎn）示申报产品（pǐn）与对比方法检测结果的一（yī）致性为（wéi）100%（95%置（zhì）信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大样本中目标外显子△△Ct分布范（fàn）围的调查亦显示，该产品的纯合（hé）突变（biàn）判断界（jiè）值设置合理（lǐ）。

　　该试剂目前批（pī）准的预期用途仅（jǐn）包含纯合缺（quē）失的检测（cè），尚不能用于杂合缺失的检测（cè），因此无法用于SMA携（xié）带者的筛（shāi）查，这是该产（chǎn）品的缺陷之一（yī）。

　　事（shì）实上，该产品在设（shè）计上已考虑（lǜ）到SMA携带者的（de）检（jiǎn）测，其检测原理是以（yǐ）待测（cè）样本中目标外显子荧（yíng）光信（xìn）号Ct值（zhí）与内参基因荧光信号Ct值之（zhī）差（△Ct_s），与正常对照品三个梯度稀释品中目标外显子（zǐ）荧光信（xìn）号Ct值和内参基因荧（yíng）光信号Ct值之差（chà）的平均值（zhí）（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为待测样本中目标外显（xiǎn）子拷贝数（shù）检测变（biàn）量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时（shí）荧光定量PCR相对定量的基本数学原理推导得到申报产品检测变量（liàng）△△Ct的（de）计算公式，依据这一计算（suàn）公式可（kě）推（tuī）导出纯合缺失、杂（zá）合缺失（shī）和野（yě）生型的△△Ct理论值（或范围）；再（zài）结合目标外显子（zǐ）与内参基因扩增效率（lǜ）差（chà）异以及SMN2不同拷（kǎo）贝（bèi）数（shù）的（de）影响，可（kě）对上述△△Ct理论值进行优化。结果（guǒ）显示纯合缺失、杂（zá）合缺失和野生型的（de）△△Ct值（或范围）之间可设置合（hé）理的判断（duàn）界值，因此理论上该产品可分别（bié）检（jiǎn）测出（chū）三（sān）种基（jī）因状态。但鉴于生产企业对杂（zá）合缺失（shī）与野生型之间的判断界值研究尚不透彻，再加上缺（quē）乏可判定杂合缺（quē）失（shī）的对比方法等（děng）其（qí）他困难，本次注册申请的预期用（yòng）途（tú）仅限（xiàn）于检测（cè）纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显子（zǐ）缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带（dài）者筛（shāi）查中具有重要的（de）临（lín）床价值。然而到目前为止，受到技术水平的限制（zhì），相关的体外诊断试剂比较（jiào）缺（quē）乏，特别是可用于SMA携带者（zhě）筛查（chá）的杂合缺失检测，尚无适合（hé）的体外诊断试剂（jì）上市。（器审中心审评六部  何静云）

来源：中国医药报